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应用小分子PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物探讨

发布时间:2020-05-20 08:20:44 | 来源:【药物研发团队 2020-05-20】
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冠状病毒在系统分类上属套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属。冠状病毒属的病毒是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒,是自然界广泛存在的一大类病毒。

冠状病毒直径约80~120nm,基因组5′端具有甲基化的帽状结构,3′端具有poly(A)尾,基因组全长约27-32kb,是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒,仅感染脊椎动物,如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。

冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来,病毒颗粒的直径60~200nm,平均直径为100nm,呈球形或椭圆形,具有多形性。病毒有包膜,包膜上存在棘突,整个病毒像日冕,不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV,引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒,其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸窘迫综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。

冠状病毒引起的人类疾病主要是呼吸系统感染,发病机制主要是冠状病毒侵入人的呼吸道表面的纤毛上皮细胞后,在其内复制和扩散,并直接引起受染细胞损伤,造成局部病变或产生全身毒血症状。进入二十一世纪以来,冠状病毒已经造成了三次引发全球关注的重大突发公共卫生事件,分别是2002~2003年的SARS-CoV、2012年的MERS-CoV和2019~2020年的SARS-CoV-2(2019-nCoV),特别是SARS-CoV-2引发了全球大流行,严重影响人类生命健康及全球社会经济稳定和发展。

由于冠状病毒是自然界广泛存在的、可感染人类的、不断进化变异的一大类病毒,没有特效药物和疫苗,因此,冠状病毒的每一个新变种在人类的传播都可能引发重大突发公共卫生事件,严重危胁人类的生命健康和社会经济发展。通过对冠状病毒进化变异规律的深入研究,寻找针对冠状病毒共同特性的药物,已成为全人类战胜冠状病毒、保护自身生命健康的重要而紧迫的使命和任务。而小分子PROTAC/PHOTAC技术可能在完成这一使命和任务中发挥作用。

1)小分子PROTAC技术

蛋白水解靶向嵌合分子(protein proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)是一种可以募集蛋白和靶蛋白降解酶的杂合双功能化合物,利用泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白。因为PROTAC有将无法成药的蛋白质作为靶蛋白的潜力以及可能在药物耐药中发挥作用的优势,近年来己赢得了广泛关注。

PROTAC是Crews等于2001年首次报道的一种利用泛素-蛋白酶体降解蛋白的化合物。其由E3泛素连接酶配体和蛋白质配体,通过连接基组合而成。E3泛素连接酶给目标靶蛋白加上泛素化蛋白标签,可以启动细胞内强大的泛素化水解过程,利用泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白。蛋白质降解可以通过靶蛋白表面上的任何结合位点介导,而不是局限于单个可识别的活性位点,可能更容易开发简单有效和选择性高配体,使没有成药性的蛋白质具有成药价值;同时,降解蛋白不会出现抑制蛋白时的代偿性增加或突变情况,可以有效解决耐药性问题,所以降解靶蛋白的特性使PROTAC分子具有将无法成药蛋白质作为靶蛋白的潜力以及可能在药物耐药中发挥作用的优势。

最初的多肽类PROTAC分子存在着较大的跨膜问题与药效问题,故现研宄重点多在小分子类PROTAC上。现在的PROTAC分子设计的E3泛素连接酶配体部分多选用鼠双微基因(MDM2)、细胞凋亡抑制蛋白(cIAP)、希佩尔-林道蛋白(pVHL)和Cereblon(CRBN)的配体,己有文献对4种E3连接酶的PROTAC小分子进行了相关报道,主要针对在细胞各个分部区域中的靶点都有相应的PROTAC小分子报道,证明根据合适的蛋白配体、E3泛素连接酶配体所设计的PROTAC分子可以对核内蛋白、跨膜蛋白、胞浆蛋白有相应的降解作用。[1]

2)小分子PHOTAC技术

尽管小分子PROTAC技术有许多优势,但是,如果目标蛋白同时在病变细胞和正常细胞中都具有功能或脱靶,PROTAC药物可以导致所有细胞内的目标蛋白降解消失,从而带来严重的安全性风险,产生严重的毒副作用。

因此,需要对现有PROTAC技术进行改进、完善,防范蛋白降解剂的安全性风险。

光控靶向蛋白降解(PHOTAC)技术就是一种理想的解决方案,它是一种具有时空定位作用的PROTAC技术,在组织或细胞中实现局部精准的PROTAC的活化,从而避免其发生毒副作用。

实现药物的定位作用最常用的一种方式就是光控。纽约大学Dirk Trauner教授团队发展的这种光控靶向蛋白质降解技术(PHOTAC),其核心为一个三功能小分子,除了PROTAC技术原来的两种功能以外,进一步引入了偶氮苯的结构作为光开关,从而实现可控的靶向蛋白质降解。偶氮苯机构是最小的光控开关,作为取代基是基本不会增加药物的分子量,且具有很好的生物兼容度,可预测的几何变换以及易调节的光热特性。因此该研究团队对常规反式更稳定的偶蛋白以及顺式更稳定的二氮芳辛类化合物,以及将这些光控基团插入功能分子的不同位置的小分子进行筛选。

该研究团队首先选择应用最广泛的CRBN作为靶向的E3泛素连接酶和BET蛋白BRD2-4的高效抑制剂(+)-JQ1作为模型,合成了13个小分子进行尝试,发现PHOTAC-I-3具有最好的效果,在390nm光激活条件下有7倍EC50的降低。研究团队进一步在RS4;11细胞中利用蛋白免疫印迹法证明了对于BRD2-4的靶向降解,可以看到在24小时内蛋白被持续降解,C-MYC的下调,以及PARP被切割的部分增加,这种细胞凋亡信号的产生也与细胞活力实验中检测的相吻合,而黑暗处理条件下c-MYC水平的下降可能是由于(+)-JQ1衍生物PHOTAC-I-3抑制BRD4产生的。研究团队为了证明该技术的普适性,进一步结合了FKBP的合成配体SLF,合成了光控小分子,并进行了与前面相同的实验验证,证明光控靶向蛋白降解技术(PHOTAC)具有普适性,实现对靶向蛋白降解的精确调控,避免蛋白降解剂发生毒副作用,在蛋白降解剂药物研发领域取得重大突破,具有理程碑意义,将极大地促进疑难杂症、罕见病、严重危害人类生命健康的重大疾病治疗药物的研发。在未来,由E3连接酶配体、光开关和目标蛋白质配体组成的新型光控PROTAC将为精准医疗和降低药物毒性,以及新药开发方面提供有力的支撑。[2] [3]

尽管到目前为止PROTAC、PHOTAC技术正在快速发展,但这些技术主要集中在抗肿瘤药物研发领域,尚未见应用小分子PROTAC/PHOTAC技术抗冠状病毒感染药物研究的相关报道。

3)应用小分子PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物探讨

PROTAC/PHOTAC技术主要是降解蛋白。因此,应用PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物,就必需了解冠状病毒的形态结构、蛋白特点以及冠状病毒感染宿主细胞的机制。

1】冠状病毒形态结构、蛋白特点

冠状病毒(CoVs)是迄今为止被鉴定出的最大的RNA病毒,冠状病毒科分为4个属,分别为α,β,δ和γ冠状病毒,而β冠状病毒又分为A,B,C和D谱系。可以感染人类的七种冠状病毒(HCoV)包括α冠状病毒中的HCoV-229E和HCoV-NL63,β冠状病毒谱系A中的HCoV-OC43和HCoV-HKU1,β-冠状病毒谱系B中的SARS-CoV和SARS-CoV-2;β-冠状病毒谱系C中的MERS-CoV。

冠状病毒粒子呈不规则形状,直径约60-220nm。病毒粒子外包着脂肪膜,膜表面有三种糖蛋白:刺突糖蛋白(S蛋白,是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点);小包膜糖蛋白(E蛋白,较小,与包膜结合的蛋白);膜糖蛋白(M蛋白,负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。少数种类还有血凝素糖蛋白(HE蛋白)。冠状病毒的核酸为非节段单链(+)RNA,长27-31kb,是RNA病毒中最长的RNA核酸链,具有正链RNA特有的重要结构特征:即RNA链5’端有甲基化“帽子”,3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似,也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础,而省去了RNA-DNA-RNA的转录过程。冠状病毒的RNA和RNA之间重组率非常高,病毒出现变异正是由于这种高重组率。重组后,RNA序列发生了变化,由此核酸编码的氨基酸序列也变了,氨基酸构成的蛋白质随之发生变化,使其抗原性发生了变化。而抗原性发生变化的结果是导致原有疫苗失效,免疫失败。

2】冠状病毒感染宿主细胞机制

冠状病毒成熟粒子中,并不存在RNA病毒复制所需的RNA聚合酶,它进入宿主细胞后,直接以病毒基因组RNA为翻译模板,表达出病毒RNA聚合酶。再利用这个酶完成负链亚基因组RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成,以及病毒基因组RNA的复制。冠状病毒各个结构蛋白成熟的mRNA合成,不存在转录后的修饰剪切过程,而是直接通过RNA聚合酶和一些转录因子,以一种“不连续转录”的机制,有选择性的从负义链RNA上,一次性转录得到构成一个成熟mRNA的全部组成部分。结构蛋白和基因组RNA复制完成后,将在宿主细胞内质网处装配生成新的冠状病毒颗粒,并通过高尔基体分泌至细胞外,完成其生命周期。

冠状病毒的生长多位于上皮细胞内,也可以感染肝脏、肾、心脏和眼睛,在另外的一些细胞类型(例如巨噬细胞)中也能生长。人类冠状病毒还没有合适的可作研究用的动物模型。

冠状病毒的血清型和抗原变异性还不明确。冠状病毒可以发生重复感染,表明其存在有多种血清型(至少有4种已知)并有抗原的变异,其免疫较困难,尚无特异的预防和治疗药物。

最新研究表明,当冠状病毒的棘突蛋白与宿主细胞的受体结合时,病毒进入细胞,再剥离包膜,使基因组RNA存在于细胞质中。ORF1a和ORF1b基因分别由基因组RNA转化为pp1a和pp1ab蛋白。

利用蛋白酶切割pp1a和ppa1b蛋白,共得到16种非结构蛋白。一些非结构蛋白形成复制/转录复合体(RNA复制酶,RdRp),它使用(+)链基因组RNA作为模板。通过复制过程产生的(+)链基因组RNA成为新病毒颗粒的基因组。通过转录产生的亚基因组RNA被转化为结构蛋白(S蛋白,E蛋白,M膜蛋白,N衣壳蛋白),形成病毒颗粒。棘突蛋白、包膜蛋白和膜蛋白进入内质网,核衣壳蛋白和(+)链基因组RNA结合形成核蛋白复合体。它们在内质网-高尔基体区融入完整的病毒颗粒,通过高尔基体和囊泡排泄到细胞外区。

作为一种RNA病毒的冠状病毒进入宿主细胞,复制基因组RNA,产生许多较小的 RNA (称为“亚基因组RNA”)。这些亚基因组RNA被用于合成冠状病毒谱系开始所需的各种蛋白(棘突突起、包膜等)。因此,较小的RNA是干扰冠状病毒破坏人体免疫系统的很好目标。

韩国基础科学研究所(IBS)RNA研究中心(Center for RNA Research)的研究团队金纳里(Kim v.Narry)和张海希克(Chang Hyeshik)教授领导的研究小组,与韩国疾病控制与预防中心(KCDC)的韩国国家健康研究所(KNIH)合作,成功剖解了SARS-CoV-2 RNA基因组的结构。研究人员通过实验证实了预测的亚基因组RNA,这些RNA反过来又转化为病毒蛋白。

此外,他们还分析了每个RNA的序列信息,揭示了基因在基因组RNA上的确切位置。该团队不仅详细研究了SARS-CoV-2的结构,还发现了许多新的RNA和病毒RNA上多种未知的化学修饰。该项研究工作提供了SARS-CoV-2的高分辨率地图。这张地图将有助于了解病毒是如何复制的,以及它是如何逃脱人类免疫系统的防御的。

在此之前,已知有10个亚基因组RNA组成病毒颗粒结构。然而,该研究团队证实实际上存在9个亚基因组RNA,使剩下的一个亚基因组RNA失效。研究人员还发现,由于RNA的融合和缺失,存在许多未知的亚基因组RNA。虽然还需要进一步的研究,但这些分子事件可能导致冠状病毒的相对快速进化。此外,该研究团队还在病毒RNA上发现了多种未知的化学修饰。目前还不清楚这些修饰起什么作用,但可能是它们可以帮助病毒避免来自宿主的攻击。

该研究团队认为,修饰RNA可能具有不同于未修饰RNA的新特性,即使它们在 RNA 基础序列方面具有相同的遗传信息。 他们相信,如果他们弄清了RNA的未知特性,这些发现可能会为对抗冠状病毒提供新的线索。新发现的化学修饰也将有助于了解病毒的生命周期。

这项研究的成功背后是该研究团队配对的两种互补测序技术—DNA纳米球测序和纳米孔 RNA 直接测序。纳米孔RNA直接测序可以直接分析整个长病毒RNA而不会被破坏。

传统的RNA测序方法在阅读RNA之前,通常需要一步一步地切割RNA并将其转化为DNA。同时,DNA纳米测序只能读取短片段,但具有分析大量序列的高精度优势。事实证明,这两种技术在分析病毒RNA方面具有很强的互补性。[4]

新冠状病毒的高分辨率基因图谱可以引导大家找到所有SARS-CoV-2 RNA(转录组)和所有修饰RNA(表位脚本组)上的每一位基因。现在是时候探索新发现的基因的功能和冠状病毒基因融合的机制。该团队还将进一步研究RNA修饰,看看它们是否在病毒复制和免疫反应中发挥作用。该团队的研究将有助于诊断学和治疗学的发展,以更有效地对抗击冠状病毒,也给应用小分子PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物带来了希翼。

3】应用小分子PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物探讨

针对冠状病毒蛋白特点及冠状病毒感染宿主细胞机制,探讨应用小分子PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物的可行性,对于防控冠状病毒感染疾病和疫情具有重要意义。

①针对冠状病毒S蛋白

S蛋白(刺突蛋白)介导冠状病毒识别宿主细胞受体,促进其与细胞膜的融合是冠状病毒感染宿主细胞共同的生物学特性。S蛋白由两个亚基S1与S2组成。

在冠状病毒体上S蛋白的S1亚基中的RBD与靶细胞的ACE2受体结合后,S蛋白S2亚基中的七肽重复序列1(HR1)和2(HR2)结构域彼此相互作用形成六个-螺旋束(6-HB)融合核心,使病毒和细胞膜紧密融合和感染。

有研究人员设计了针对HCoV S蛋白HR1结构域的泛冠状病毒融合抑制剂EK1,事实证明它可以有效抑制5种HCoV的感染,包括SARS-CoV和MERS-CoV,以及3种SARS-相关CoV(SARSr-CoV)。[5]

由此可见,S1亚基的受体结合域(RBD)可作为应用小分子PROTAC/PHOTAC技术研发抗冠状病毒感染药物作用的重要靶点,通过直接降解冠状病毒的S蛋白,阻断冠状病毒与宿主细胞受体的结合,使冠状病毒失活,从而防止冠状病毒感染。

②针对冠状病毒受体蛋白(ACE2)

血管紧张素酶2(ACE2)是一种羧肽酶,也是一种蛋白受体,广泛分布于人体各器官。研究表明,冠状病毒通过其S蛋白上的受体结合域(RBD)与ACE2相结合进入细胞,其与宿主细胞ACE2蛋白结合具有很强的结合自由能。因此,针对人细胞表面受体ACE2蛋白,应用小分子PROTAC/PHOTAC技术,研发抗冠状病毒感染药物,靶向与病毒结合的ACE2受体蛋白,可能会具有阻止冠状病毒快速大量复制扩增,抑制冠状病毒感染,防止重型、危重型冠状病毒感染疾病发生,降低病死率的作用。

③针对冠状病毒复制相关蛋白

冠状病毒的非结构蛋白对病毒的复制和组装等过程起着非常重要的作用,其中,3-胰凝乳样蛋白酶(3CLpro)、木瓜样蛋白酶(PLpro)参与多肽翻译,RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)参与病毒复制。因此,针对这三种蛋白酶,应用小分子PROTAC/PHOTAC技术,研发抗冠状病毒感染药物,可能会有阻断冠状病毒复制,防止冠状病毒感染的作用。

④针对亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD1)

MTHFD1是一碳单位的代谢过程的关键合成酶,在之前的基于人类细胞的高通量筛选中没有被发现过。近日,清华大学研究团队首次通过蝙蝠细胞的高通量筛选得到的分子。且这个分子在蝙蝠中的表达水平相比人类是很低的,MTHFD1又可以促进病毒的复制,所以有可能MTHFD1这个酶在蝙蝠中的低表达使得病毒在蝙蝠中的复制水平较低。RNA病毒的复制依赖MTHFD1合成酶功能,可能与病毒侵入细胞后需要大量核苷(酸)用于复制病毒自身的RNA相关。[6]

因此,针对MTHFD1,应用小分子PROTAC/PHOTAC技术,研发抗冠状病毒感染药物,可能会有阻断冠状病毒复制,防止冠状病毒感染的作用。

综上所述,针对冠状病毒及其感染宿主细胞的生物学特性,应用小分子PROTAC/PHOTAC技术,研发抗冠状病毒感染药物,对于克服由于病毒不断进化易变异而难以开发特效抗病毒药物的难题、解决冠状病毒耐药性问题、治疗冠状病毒感染性疾病、防止重大突发公共卫生事件的发生和发展具有重要意义,值得大家深入研究探讨。

 

参考文献

[1] 王媛等,小分子PROTAC在不同靶点研究中的应用,药学学报,2020,55(3):446~452

[2] Jing Liu ,et al.Light-induced control of protein destruction by opto-PROTAC  ,Science Advances 21 Feb 2020:Vol. 6, no. 8, eaay5154 DOI: 10.1126/sciadv.aay5154

[3] Martin Reynders ,et al. PHOTACs enable optical control of protein degradation, Science Advances  21 Feb 2020:Vol. 6, no. 8, eaay5064 DOI: 10.1126/sciadv.aay5064

[4]More information: Kim, D et al. The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome. Cell (2020) DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.011

[5] 陆路等,Inhibition of SARS-CoV-2 (previously 2019-nCoV) infection by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion,Cell Research,2020-3-30

[6] 清华大学等,Orthogonal genome-wide screenings in bat cells identify MTHFD1 as a target of broad antiviral therapy,预印本网站BioRxiv在线发表,2020年3月31日

 

本文综合整理自南昌威尼斯药业研发团队,欢迎转发,禁止转载。转载授权请联系0791-88161315。

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